Biologi: Pewarnaan gram pada bakteri

Apa kalian tau apa itu pewarnaan gram?Bagaimana cara pewarnaan gram pada bakteri?dan apa saja contohnya?dll.Semua itu akan saya bahas di sini,semoga bermanfaat😄😄.

A.Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut: zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif.Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.

Bakteri gram-positif antraks (batang ungu) pada contoh cairan serebrospina. Jika ada, bakteri spesies gram-negatif akan berwarna merah muda. (Sel-sel lain adalah sel darah putih

Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

B. Pewarnaan Gram Positif

Gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop.Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90 persen dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat.Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel.Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya.

C.Pewarnaan Gram Negatif

Disisi lain, bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda.Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram. Prosedur ini ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri.

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop.Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop.

D.Karakteristik

Berikut ini adalah karakteristik dari bakteri Gram positif dan negatif. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 2002. Microbiology. 5th Ed. Boston: McGraw-Hill.

Karakteristik	Gram positif	Gram negatif
Dinding sel	Homogen dan tebal (20-80 nm) serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.	Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dalam dan luar, serta adanya membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdiri dari lipid, protein, dan lipopolisakarida
Bentuk sel	Bulat, batang, atau filamen	Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seperti tanda koma, heliks atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul
Reproduksi	Pembelahan biner	Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan
Metabolisme	kemoorganoheterotrof	Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof
Motilitas	Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous)	Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar, lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous).
Anggota tubuh (apendase)	Biasanya tidak memiliki apendase	Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
Endospora	Beberapa grup dapat membentuk endspora	Tidak dapat membentuk endospora

E.Cara Kerja

Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

1. Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).

2. Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ).

3. Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam.

4. Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.

Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas saring.

Perlu kita ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan bakteri tadi, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor, antara lain:

a) Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough).

b) Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami sedikit perubahan.

c) Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll.

Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika gentian violet tidak ada.

· Larutan Standard Gentian Violet.

Bubuk (kristal) gentian violet : 5 gram.

Alkohol 95-96% : 95 ml.

· Larutan Pakai.

Larutan standard gentian violet : 10 ml.

Karbol (phenol) 5% : 90 ml.

· Larutan Standard Fuchsin.

Bubuk (kristal) fuchsin : 5 gram.

Alkohol 95-96% : 95 ml.

· Larutan Pakai.

Larutan standard fuchsin : 10 ml.

Aquadest : 90 ml.

Bubuk digerus dalam mortir dengan alkohol sedikit demi sedikit, setelah larut masukkan ke dalam botol (untuk gentian violet harus botol yang cokelat atau sawo matang). Genapkan volume alkohol sampai volume yang diperlukan. Biarkan 24 jam baru dapat dipakai. Jika hendak dipakai larutan stam ini harus diencerkan dahulu 10x dan disaring. Filtrat ini dipakai untuk pewarnaan.

· Larutan Lugol (J-KJ).

Jodium kristal : 1 gram

Kalium jodida (KJ) : 2 gram

Aquadest : 300 ml.

Mula-mula Jodium + KJ dalam kira-kira 10 ml aquadest. Sesudah jodium larut, genapkan volumenya menjadi 300 ml. Larutan lugol ini disimpan dalam botol yang sawo matang. Dapat juga kita sediakan larutan lugol dalam 5x atau 10x kuat. Pada waktu pemakaian encerkan dengan aquadest. Bila perlu disaring. Larutan lugol yang dibuat seperti di atas, langsung dipakai tanpa ditipiskan lagi.

Cara pewarnaan Gram :

Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x di atas api Bunsen.

Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), biarkan selama 5 menit.

Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol), diamkan selama kira-kira 1-3 menit.

Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).

Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.

Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif = ungu. Gram negatif = merah. Cara pewarnaan Gram :

Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x di atas api Bunsen.
Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), biarkan selama 5 menit.
Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol), diamkan selama kira-kira 1-3 menit.
Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).
Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.
Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif = ungu. Gram negatif = merah.

Cara pewarnaan :

~ Buat sediaan pada objek gelas, rekatkan di atas api Bunsen 3x, tunggu sampai dingin.

~ Pulas dengan karbol gentian violet selama 60 detik.

~ Cuci dengan aquadest, bubuhi lugol selama 30 detik.

~ Cuci dengan aquadest, buang zat warna dengan alkohol (decolorisasi) sampai tidak ada lagi warna yang dilepaskan dari sediaan. Boleh juga dicuci lagi dengan aquadest.

~ Pulas dengan larutan safranin (counter stain) kira-kira 30 detik.

~ Cuci dengan aquadest, biarkan kering dalam temperatur kamar dan periksa dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak.

Hasil pewarnaan Gram :

Bakteri Gram positif : Biru-ungu (ungu kebiru-biruan).

Bakteri Gram Negatif:Merah muda-merah

F.Contoh Bakteri Gram Positif dan Negatif: